Ziel war es, menschliche Embryonale Nierenzellen 293 (HEK293) zu verwenden, um die Veränderungen in Expression und Verteilung der Untereinheiten GIRK1 und GIRK2 des G-Protein-gesteuerten inward rectifying Kaliumkanals (GIRK) nach Morphin-Toleranz zu beobachten. Methode: HEK293-Zellen wurden mit Lentivirus pLV-CMV-GIRK1-T2A-GIRK2-P2A-MOR transfiziert, um stabile Zellen zu erzeugen, die GIRK1, GIRK2 und μ-Opioid-Rezeptor (MOR) überexprimieren. Diese stabilen Zellen wurden 24 h mit Morphin (1 μmol/L) behandelt, um ein Morphin-Toleranz-Modell zu erzeugen. Die Immunfluoreszenzdetektion untersuchte die Verteilung und Kolokalisation von MOR mit GIRK1 und GIRK2 im Zellmodell. Der cAMP-Gehalt wurde durch ELISA gemessen, um die Erstellung des Morphin-Toleranz-Modells zu bestätigen. Immunfluoreszenz und Western Blot analysierten die Veränderungen in Verteilung und Proteinlevel von GIRK1 und GIRK2 nach Toleranz. Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Multifunktionsmikroplattenleser gemessen, um Veränderungen des Membranpotenzials nach Toleranz zu erfassen. Ergebnisse: In stabilen HEK293-Zellen zeigte die immunfluoreszenzchemische Färbung, dass GIRK1 und GIRK2 hauptsächlich an der Zellmembran exprimiert werden, mit geringer Menge im Zytoplasma, MOR kolokalisiert mit GIRK1 und GIRK2 sowie GIRK1 mit GIRK2. Im Vergleich zur Kontrolle sank der cAMP-Spiegel nach 1 Stunde Morphin-Behandlung signifikant (1,42±0,07 vs. 0,72±0,12, P=0,0010), während er nach 24 Stunden signifikant anstieg (0,72±0,12 vs. 1,98±0,17, P=0,0005). Die Doppel-Fluoreszenzfärbung zeigte nach 24 Stunden Morphinbehandlung eine signifikante Zunahme von GIRK1 (13,76±7,67 vs. 3,72±16,02, P<0,0001) und GIRK2 (7,16±2,61 vs. 2,92±7,67, P=0,0029) im Zytoplasma der Toleranzgruppe. Western Blot zeigte nach Toleranz eine signifikante Herabregulierung der Membranproteine GIRK1 (1,11±0,14 vs. 0,85±0,01, P=0,0045) und GIRK2 (1,32±0,02 vs. 0,86±0,08, P=0,0001). Die Membranpotentialmessung zeigte eine signifikant verminderte Hyperpolarisationsreaktion in den toleranten Zellen (-15,53±0,12)% vs. (-8,17±0,11)%, P<0,0001. Fazit: Chronische Morphinbehandlung kann die Herunterregulierung der Membranexpression von GIRK1 und GIRK2 in stabilen HEK293-Zellen induzieren.

Morphin; Toleranz; menschliche embryonale Nierenzellen 293; Untereinheit des G-Protein-gesteuerten inward rectifying Kaliumkanals 1; Untereinheit des G-Protein-gesteuerten inward rectifying Kaliumkanals 2