Целью было использование клеток эмбриональной почки человека 293 (HEK293) для наблюдения за изменениями экспрессии и распределения субъединиц GIRK1 и GIRK2 G-белок-зависимых внутренне направленных калиевых каналов (GIRK) после толерантности к морфину. Метод: клетки HEK293 трансфицировали лентивирусом pLV-CMV-GIRK1-T2A-GIRK2-P2A-MOR для создания стабильной линии, сверхэкспрессирующей GIRK1, GIRK2 и μ-опиоидный рецептор (MOR). Эти клетки обрабатывали морфином (1 мкмоль/л, 24 ч) для моделирования толерантности к морфину. Иммуннофлуоресцентная микроскопия использовалась для определения распределения и ко-локализации MOR с GIRK1 и GIRK2. Изменения уровня cAMP определялись с помощью ELISA для подтверждения модели толерантности. Иммуннофлуоресценция и вестерн-блот применялись для оценки изменений в распределении и уровне белков GIRK1 и GIRK2 после толерантности. Флуоресцентный анализ с помощью мультифункционального микропланшетного считывателя определял изменения потенциала мембраны после толерантности. Результаты показали, что в стабильных клетках HEK293 иммуннофлуоресценция выявила преимущественное экспрессирование GIRK1 и GIRK2 на мембране с небольшой экспрессией в цитоплазме, ко-локализация MOR с GIRK1, GIRK2, а также ко-локализация GIRK1 и GIRK2. По сравнению с контролем, после 1 часовой обработки морфином уровень cAMP значительно снизился (1.42±0.07 против 0.72±0.12, P=0.0010), а после 24 часов значительно повысился (0.72±0.12 против 1.98±0.17, P=0.0005). Двойная флуоресцентная окраска показала значительное увеличение GIRK1 (13.76±7.67 против 3.72±16.02, P<0.0001) и GIRK2 (7.16±2.61 против 2.92±7.67, P=0.0029) в цитоплазме у группы толерантности после 24 часов морфиновой обработки. Вестерн-блот показал значительное снижение экспрессии мембранных белков GIRK1 (1.11±0.14 против 0.85±0.01, P=0.0045) и GIRK2 (1.32±0.02 против 0.86±0.08, P=0.0001) после толерантности. Измерение потенциала мембраны выявило значительное ослабление гиперполяризирующего ответа у толерантных клеток (-15.53±0.12)% против (-8.17±0.11)%, P<0.0001. Вывод: Хроническая обработка морфином может индуцировать понижение экспрессии GIRK1 и GIRK2 на мембранах стабильных клеток HEK293.

морфин; толерантность; клетки эмбриональной почки человека 293; субъединица G-белок-зависимого внутренне направленного калиевого канала 1; субъединица G-белок-зависимого внутренне направленного калиевого канала 2