【目的】 快速构建大鼠LIM矿化蛋白-1基因重组腺病毒载体

转染MSC

探讨LMP-1基因对MSC成骨分化和成骨活性的影响65377; 【方法】 从大鼠成骨细胞内提取总RNA

并设计LMP-1特异性引物进行RT-PCR

获取LMP-1基因后利用Invitrogen公司的TOPO定向克隆技术创建入门克隆pENTR/D-LMP-165377;转化TOP10细菌后

挑取阳性克隆摇菌提取质粒

入门克隆再与表达载体pAD/CMV/V5-DEST进行同源重组反应得到病毒载体pAD/CMV/V5-LMP-1

转化细菌后挑选阳性克隆摇菌提取重组病毒质粒

用PacI内切酶线性化后用转染293A细胞后得到重组腺病毒载体65377;以腺病毒为载体

将大鼠LMP-1基因体外转染于3代大鼠MSC细胞内

检测LMP-1基因在MSC细胞的表达

分别观察转染后实验组与对照组I型胶原65380;碱性磷酸酶65380;骨钙素表达变化以及骨钙结节的形成情况

评价LMP-1基因的成骨能力65377;【结果】 成功获取大鼠LMP-1基因

入门质粒与病毒表达质粒经过酶切鉴定以及测序验证65377;LMP-1基因能在MSC中高效表达

转然后MSC的I型胶原

碱性磷酸酶65380;骨钙素的表达明显增强

骨钙结节形成增多65377; 【结论】 利用Gateway 技术构建LMP-1重组腺病毒载体相对简单

可快捷获得的pAd-LMP-165377;pAd-LMP-1转染MSC后

LMP-1基因能促进MSC向成骨细胞分化

增强其成骨作用65377;